L’autofécondation et l’incompatibilité des croisements chez les plantes, les manifestations chez l’olivier

Publié le: 18/11/2016 | Catégorie: Botanique-Horticulture | Mots clés: Olivier

Fleurs d’olivier – Crédit photo : André Bervillé

Catherine Breton
ISEM – (UM-CNRS, UMR5554, IRD UMR226), <catherine.breton1@umontpellier.fr>

André Bervillé
INRA UMR 1097 DIAPC, <andre.jp.berville@orange.fr>

voir sur le site la-maitrise-de-la-pollinisation-chez-lolivier et autres détaills.

Les références bibliographiques peuvent être envoyées sur demande.

Pourquoi ce texte

Il s’agit ici d’apporter, des informations rationnelles et incontestables sur l’autofécondation et l’incompatibilité des croisements chez les plantes, afin que le lecteur puisse se faire sa propre opinion sur un sujet dont les sources d’information sont très spécialisées et le plus souvent en anglais. Toutefois, il ne s’agit pas d’un article construit, comme s’il était scientifique, mais de rendre compréhensible, et donc le lecteur qui voudra disposer de la source d’information originale pourra nous la demander par courriel.
Les bases des mécanismes de la reproduction des plantes ne sont enseignées que de façon très partielle aussi bien dans l’enseignement secondaire que supérieur. C’est un aspect presque totalement délaissé au profit d’aspects beaucoup plus techniques comme la nutrition minérale, l’architecture, les maladies et ravageurs, … dont il ne s’agit aucunement de contester l’importance, mais si on veut que la production en fruits et graines soit à la hauteur des investissements, il faut savoir aussi comment les plantes produisent des fruits et des graines. Notamment chez l’olivier, dont le système de reproduction, tout à fait particulier par rapport aux autres espèces fruitières, conduit à ce que actuellement, la plupart des vergers sont en sous production chronique par manque de polliniseurs.
Le lecteur doit comprendre pourquoi.

Les bases génétiques de l’incompatibilité

Le support héréditaire des mécanismes qui permettent aux plantes de s’entre-croiser ou de se rejeter est simple. Une seule région du génome – on l’appelle le S-locus – porte quelques gènes associés en tandem. Chacun des gènes du tandem a une fonction soit dans le style et stigmate (part femelle), soit dans le pollen (part mâle). Deux des gènes, un de chaque part encode chacun une protéine (appelée déterminant), celui de la part femelle et celui de la part mâle. Ils ont une partie variable, plus ou moins longue, et de séquence en bases plus ou moins différentes. C’est cette partie variable qui porte l’information pour enclencher ou pas la réaction d’auto-incompatibilité.
* Si les 2 séquences des 2 parts diffèrent totalement par la partie variable – il n’y a donc rien en commun, alors les 2 déterminants ne déclencheront pas la réaction d’incompatibilité, et l’individu sera auto-compatible, et le croisement sera compatible.
** Si les 2 parts ont une séquence identique dans la partie variable, alors la réaction d’auto-incompatibilité se déclenchera et le croisement sera incompatible – avec un mécanisme biochimique particulier pour chaque espèce. Elle conduira à la mort, puis à la digestion des tubes polliniques qui auront germés, et des grains de pollen qui seront tombés sur le stigmate : le mécanisme de la digestion est commun à toutes les espèces, c’est l’apoptose, mécanisme qui détruit les cellules condamnées à mourir par divers mécanismes (vieillissement, hypersensibilité, …).

Les manifestations de l’incompatibilité

Pour l’expérimentateur tout se passe comme si l’incompatibilité était due à un seul gène, les événements de recombinaison sont exceptionnels dans le S-locus. La diversité entre allèles[1] se crée uniquement par des mutations. Les mutations qui affectent les S-allèles sont très rares, mais pour des espèces qui évoluent depuis des millions d’années, on observe une diversité des allèles de l’incompatibilité (S-allèles) dans les populations sauvages. La diversité se manifeste lors des croisements. Les individus couverts par un sac ne produiront pas de graines (auto-stérile) et très rarement certains pourront en produire (auto-fertile). Lors des croisements des individus 2 à 2, une paire est soit compatible soit incompatible. C’est en étudiant de nouvelles paires choisies parmi les individus incompatibles que l’on incrémente le nombre de S-allèles de l’espèce. Aucun modèle ne permet d’en prédire le nombre, on constate simplement qu’il peut atteindre plus d’une centaine d’allèles différents au S-locus chez certaines espèces des Rosacées et des Brassicées.

En revanche, les mécanismes physiologiques qui permettent la reconnaissance entre le  stigmate et le style d’une part, et le grain de pollen d’autre part, sont généralement inconnus. Ils ne sont connus que partiellement chez quelques espèces modèles comme les Prunus (Rosaceae) et les Solanaceae, et les Papavéraceae (Coquelicot) pour GSI, et, les Brassiceae (Choux, radis, Arabidopsis, …) pour SSI (Article Breton et Bervillé Annales S2HNH 2015).

Les différents types d’auto-incompatibilité GSI, LAI, et SSI

Les différents types de l’incompatibilité due à l’architecture de la fleur (chez Primevère et Jasmin), dite incompatibilité architecturale, impliquent des gènes et des mécanismes encore inconnus.
Chez toutes les autres espèces pour lesquelles l’incompatibilité est dite fonctionnelle, on a seulement classé le type d’incompatibilité du fait que la part mâle, soit, est due à un allèle, soit la part mâle est due aux deux allèles de l’individu, ou la réaction d’incompatibilité est très tardive, presque à la maturité du fruit. La classification des types d’incompatibilité fonctionnelle est en 3 types.
1- Quand chacun des grains de pollen d’un individu porte le déterminant protéique de l’allèle de son génome, il est haploïde, alors on dit que le type est gamétophytique (GSI pour gametophytic self-incompatibility). C’est le type le plus fréquent, présent chez la plupart des espèces des Rosaceae et Solanaceae. GSI existe aussi chez des Poaceae (seigle), Chenopodiaceae (betterave maritime, betterave fourragère et à sucre), Linaceae (lin sauvage), et bien d’autres familles végétales.
2- Quand chacun des grains de pollen portent les 2 déterminants protéiques des 2 allèles de l’individu qui l’a produit, alors on dit que le type est sporophytique (SSI pour sporophytic self-incompatibility). SSI existe chez quelques espèces, d’une petite dizaine de familles, dont les Betulaceae (Bouleau, noisetier), les Asteraceae (Chicorée, Senecio, Tournesol), et les Oleaceae (Olea europaea).
3- Quand la réaction d’incompatibilité ne se déclenche que très longtemps après la pollinisation, la fécondation se réalise et conduit à un fruit, qui tombera très tardivement, presque à maturité, au grand dam du cultivateur, qui ne peut relier la chute tardive des fruits à l’incompatibilité du pollen, alors on l’appelle l’incompatibilité qui agit tardivement (LAI, pour late acting incompatibility). LAI existe chez une trentaine de familles, dont celle des cacaoyers (Malvaceae ou Sterculiaceae).

Vous êtes probablement déjà effaré par le vocabulaire ‘gamétophytique’ ‘sporophytique’ et ‘déterminant’ et peut être déjà perdu dans cette complexité des manifestations de l’incompatibilité. Nous en sommes conscient, aussi allons nous tenter de vous éclairer, non en simplifiant – on s’éloignerait alors de la réalité biologique, mais en choisissant des exemples pédagogiques. Nos explications portent sur la différence entre GSI et SSI.
SSI se manifeste chez l’olivier et pose des tas de problèmes qui pour être résolus, doivent être bien décortiqués. Il faut maintenant comprendre afin d’améliorer la production des vergers.

EXPLIQUER LA DIFFÉRENCE ENTRE LES DEUX SYSTÈMES GSI ET SSI

Prenons deux urnes : l’une gamétophytique et l’autre sporophytique. Toutes les deux sont alimentées par deux tuyaux, l’un avec de la peinture noire, et l’autre avec de la peinture blanche.
1) Dans l’urne gamétophytique il y a toujours autant de boules blanches que de boules noires. c’est donc que chaque boule se forme et est peinte à la sortie de chaque tuyau, alimenté avec de la peinture pour l’un blanche, pour l’autre noire.
* Avec le système GSI chaque grain de pollen de l’individu est soit blanc soit noir, il a donc été peint après la méiose qui sépare une cellule mère en 4 grains de pollen (2 blancs et 2 noirs). Un individu produit toujours 2 types de grains de pollen, chaque grain de pollen est couvert par le déterminant qui correspond au S-allèle qu’il porte.

En termes génétiques, chaque individu d’une espèce gamétophytique contient toujours deux types de grains de pollen, chacun d’eux porte le déterminant encodé dans son propre génome. Il n’y a donc qu’un seul type d’urne gamétophytique avec toujours deux catégories de grains de pollen.              

2) Chez le type sporophytique on peut trouver 3 urnes différentes avec

1. a) que des boules noires ;
2. b) que des boules blanches ;
3. c) que des boules chacune à moitié blanche et à moitié noire.

Ici toutes les boules d’une urne sporophytique sont de la même couleur. L’explication est que dans

1. a) le tuyau avec la peinture blanche ne peint pas de boule ;
2. b) le tuyau avec la peinture noire ne peint pas de boule ; et en
3. c) la boule se fait entre les tuyaux blanc et noir qui colorent chacun la moitié de la boule.

Traduisons cela en termes génétiques pour le système SSI :

pour a) noir est dominant sur blanc (N>B);

pour b) blanc est dominant sur noir (B>N); et

pour c) noir et blanc sont co-dominants (B=N). Il se produit exactement cela pour les grains de pollen.

* Avec le système sporophytique la cellule mère des grains de pollen a été peinte selon la relation de dominance entre les allèles-S de la plante (sporophyte) qui les produit. Les grains de pollen produits par un individu portent tous les mêmes déterminants, quel que soit le S-allèle qu’il porte.

Comme nous avons pour la plupart d’entre nous, une carte de donneur de sang, l’olivier a une carte de donneur de pollen.

Sur chaque carte de donneur de sang figure si vous êtes donneur A, B, AB ou O. Vous pouvez vérifier sur votre carte.

= vous êtes un donneur A, alors vous portez dans votre génome 2 allèles soit AA soit AO,

= vous êtes un donneur B, alors vous portez dans votre génome soit BB ou BO,

= vous êtes un donneur AB alors vous portez dans votre génome A et B,

= et si vous êtes un donneur O, vous portez OO.

Ceci provient de la dominance de A et B sur O, et de la codominance de A et B (A=B>O, il n’y a que 2 niveaux de dominance).

Pour l’olivier c’est la même chose au niveau du pollen

Un olivier génère du pollen homogène avec l’un des 3 phénotypes de déterminant possibles – par rapport aux 2 S-allèles RxRy qu’il porte dans son génome :
si Rx est codominant avec Ry, alors le pollen sera couvert des 2 déterminants RxRy ;

si Rx est dominant sur Ry, alors le pollen sera couvert du déterminant Rx uniquement ;

si Ry est dominant sur Rx alors le pollen sera couvert du déterminant Ry uniquement.

Un bref rappel sur les S-allèles présents chez l’olivier

Ils sont au nombre de 6 (R1, … à R6) – soit 15 combinaisons possibles 2 à 2, sans tenir compte des combinaisons homozygotes qui n’ont pas (encore) été trouvées (voir les publications citées dans l’article sur le site S2HNH).

Chaque paire possible est R1R2, R1R3, R1R4, R1R5, R1R6, R2R3, R2R4, R2R5, R2R6, R3R4, R3R5, R3R6, R4R5, R4R6 ou R5R6

Les S-allèles ont des relations de dominance entre eux qui sont définies ainsi
R6 > R2 > R1 = R3 = R5 > R4 (> signifie dominant sur et = signifie codominant). Il y a 4 niveaux de dominance.
La dominance s’exprime dans chaque cellule mère des grains de pollen, qui délivre ainsi un seul type de grain de pollen. Ici le coloriage se fait avant la méiose, l’olivier est

soit donneur de pollen R1, quand l’individu porte R1R4

soit donneur de pollen R2, quand l’individu porte soit R1R2, R2R3, R2R4, soit R2R5

soit donneur de pollen R3, quand l’individu porte R3R4

soit donneur de pollen R5, quand l’individu porte R4R5

soit donneur de pollen R6, quand l’individu porte soit R1R6, R2R6, R3R6, R4R6, soit R5R6

soit donneur de pollen R1R3, quand l’individu porte R1 et R3

soit donneur de pollen R1R5, quand l’individu porte R1 et R5

soit donneur de pollen R3R5, quand l’individu porte R3 et R5
R4 n’a pas été trouvé. Le donneur de pollen R4 serait l’individu homozygote R4R4.
Par exemple : une variété R1R6 (le pollen est R6) ne peut féconder aucune autre variété qui porte R6 quel que soit l’autre allèle. Néanmoins R6 est rare (6 variétés sur 130). Considérons alors les paires R1R2, R2R3, R2R4, et R2R5, (le pollen est R2 il ne peut fertiliser aucune variété portant R2 (sauf si R6 est présent chez le mâle, puisque R6 masque R2 (R6>R2).
Un modèle est toujours transitoire. Pour réfuter un modèle, Il faut apporter des preuves qu’il est faux, c’est à dire montrer qu’il conduit à des incohérences entre les observations et les prédictions. Nous les attendons pour celui-ci, cela fait maintenant 4 ans.

Dans la publication récente de Marchese et al. (2015) la paire de S-allèles attribuée à 2 des variétés (Arbequina et Koroneiki) est contestée. Toutes les données de croisements que nous avons utilisées proviennent des publications référencées. Nous n’avons aucun moyen de contrôler la conformité des variétés utilisées par les auteurs qui contestent. En ce qui concernent les résultats publiés par Nathalie Moutier, Georgios Koubouris, et Daniela Farinelli, les arbres sont les références dans les collections en France (Montpellier), en Grèce (Chania Crète), et en Italie (Perugia). Si des discordances apparaissent pour les S-alléles portés par des individus de vergers constitués de plants commerciaux, alors il faudra comparer les profils moléculaires des plants commerciaux à ceux utilisés par Nathalie Moutier, Geogios Koubouris et Daniela Farinelli. En revanche, personne n’a contesté que le modèle sporophytique s’applique à l’olivier.

L’intérêt du modèle est qu’un fois une paire de S-allèles et le type de pollen sont déterminés, alors

1) ce seront toujours cette paire et toujours ce type de pollen dans n’importe quel croisement. Il n’y a plus à y revenir.

Et

2) on prédit le comportement de cette variété en croisement avec n’importe quelle autre variété dont on connaît aussi la paire de S-allèles.

La ou les méthodes utilisées pour déterminer les S-allèles des variétés de l’olivier par différentes équipes doivent conduire à des conclusions identiques. Si ce n’est pas le cas, c’est donc que la méthode utilisée n’est pas neutre, et il faut savoir en quoi.

Évidemment, rien ne permet de distinguer le déterminant que porte le grain de pollen (noir, blanc ou bicolore n’est donc pas visible), c’est nous qui sommes aveugles, car la plante sait reconnaître le déterminant que nous ne connaissons ni ne voyons pas.

ALORS COMMENT SAVOIR SI LE SYSTÈME EST GAMÉTOPHYTIQUE OU SPOROPHYTIQUE?

Pour ce faire il faut réaliser des croisements contrôlés entre individus (si possible sauvages) de l’espèce, et repérer les paires inter-incompatibles.

Dès lors, les individus inter-incompatibles avec l’individu X devront être croisés entre eux :

*si toutes ces nouvelles paires sont inter-incompatibles entre elles, alors le système est gamétophytique.

**Si parmi les paires, quelques paires sont inter-compatibles alors le système est sporophytique.

Conclusion : il n’y a pas de tests stricts pour déclarer le système gamétophytique ou sporophytique. On comprend dès lors, que si par malchance, il n’y a pas de paires inter-compatibles entre les individus incompatibles avec X, alors on pourra considérer abusivement le système comme gamétophytique, alors qu’il est sporophytique. Ce fût le cas chez l’olivier.

Pourtant l’on savait depuis les travaux de Musho (1977), réalisés chez Pierre Villemur, que si Picholine et Tanche sont inter-incompatibles, que si Tanche et Bouteillan sont inter-incompatibles ; Picholine est un polliniseur de Bouteillan et vice versa. Or, cette conclusion évidente du fonctionnement d’un système sporophytique n’a jamais été énoncée, elle est la seule (bien d’autres paires le permettent aussi) qui permet de déclarer le système sporophytique, jusqu’à ce que nous l’ayons fait en 2012.

On comprend dès lors, que les chercheurs qui n’ont étudié que quelques croisements entre variétés d’olivier, aient conclu prématurément que le système était gamétophytique :

3 variétés chez Bradley et Griggs (1963),

5 variétés chez Wu et al. (2002),

5 variétés chez Mookerjee et al. (2005),

2 variétés chez Diaz et al. (2006),

alors que Musho (1977) a étudié 15 variétés,

que Ouksili (1983) en a étudié une vingtaine, Villemur et al. (1984) une vingtaine,

que Moutier et al. (2006) en ont étudié 23,

et que Farinelli et al. (2006) en ont étudié 25.

Toutes les études montrent alors, de façon indubitable, que effectivement certaines des variétés inter-incompatibles avec Lucques, et d’autres,.. sont parfaitement compatibles entre elles Picholine x Aglandau, Picholine x Bouteillan, Picholine x Verdale de l‘hérault …

Ceci pose le problème des conclusions tirées prématurément à partir des croisements chez l’olivier, quand on a pas effectué suffisamment de croisements, et de plus, pour une paire de variétés il faut étudier les deux directions de croisements possibles de chaque paire !

* Quand le système est gamétophytique toutes les variétés qui sont inter-incompatibles avec X portent la même paire de S-allèles que X. Toutes les autres combinaisons de paires sont inter-compatibles, car les 2 variétés différent entre elles par au moins 1 des deux S-allèles, et si la réaction d’incompatibilité est déclenchée pour l’allèle en commun, l’autre grain de pollen est compatible. Un grain de pollen sur deux est détruit, l’autre fonctionne. on dit que la pollinisation est partielle (Voir l’article Breton et Bervillé 2014) dans le Nouvel olivier, ou les Annales de la S2HNH, Breton et Bervillé (2015) à demander aux Auteurs.

** Quand le système est sporophytique, comme chaque variété porte 2 S-allèles, l’incompatibilité de l’autofécondation ou du croisement est due, respectivement, à un , si dominance, ou deux si codominance, déterminants. Donc, toutes les paires de variétés qui portent 1 même S-allèle dominant seront inter-incompatibles, alors que si l’une porte 1 allèle dominant et l’autre un autre allèle dominant sans autre S-allèle commun, alors elles seront inter-compatibles dans les deux directions. De plus, les paires de variétés qui portent 2 S-allèles dominants différents et partagent un même S-allèle récessif donnent des croisements réciproques opposés, l’un incompatible et l’autre compatible. Pour exemples, Musho a démontré en 1977 d’une part, que Olivière (R2R4) x Picholine (R1R3) est compatible, mais que Picholine (R1R3) x Olivière (0 pollen) ne fait pas de fruit, parce que Olivière ne fait pas de pollen (Besnard et al. 2000). D’autre part, Picholine (R1R3) x Tanche (R2) est compatible alors que et Tanche (R2R3) x Picholine (R1R3) est incompatible.
C’est publié depuis 41 ans. Et pourtant, il a fallu attendre 2012 pour le remettre à l’ordre du jour.

Les lecteurs des articles des publications scientifiques accessibles par internet peuvent donc être abusés par les conclusions prématurées tirées des croisements. Il est évident que les chercheurs Espagnols, Australiens, Américains ont soigneusement choisi les paires de variétés pour qu’il n’y ait pas de différences dans les croisements réciproques. Donc toutes les conclusions qu’ils ont portées sur le système d’auto-incompatibilité de l’olivier sont plus ou moins erronées, car ils ont raisonné sur des croisements biaisés par l’échantillonnage. Le mérite de Nathalie Moutier et de Daniela Farinelli est d’avoir publié des résultats non biaisés qui nous ont permis d’avancer en utilisant le modèle sporophytique.

Une même équipe affirme que l’olivier est du type gamétophytique et affirme que l’olivier est du type sporophytique ! !

Nos prédécesseurs chercheurs ont révélé les deux systèmes gamétophytique et sporophytique en étudiant dans les années 1940-1950 des milliers de croisements qu’ils ont suivi en observant la germination du pollen sur les stigmates chez plusieurs espèces. Plusieurs dizaines de milliers d’observations ont conduit à ces deux modèles. Récemment LAI a été très bien documentée (2000-2015) (Gibbs 2015). Dans les années 1990-2000, des chercheurs ont identifié la protéine ‘déterminant’ codées par la région variable pour la part femelle, puis bien après le ‘déterminant’ de la part mâle pour 3 espèces ; 1) le Pétunia (Solanaceae, du type GSI), les Prunus (GSI) et 2) Arabidopsis (SSI).
Pour le système des Prunus et des Solanacées la part femelle est une S-RNAse dite H, pour la différencier des autres RNAses qui œuvrent dans la cellule. La S-RNASe induite par l’incompatibilité détruit les ARN messagers du pollen qui ne peut pas survivre.

Pour le système sporophytique chez les Brassiceae il s’agit d’une SRK-kinase dans la part femelle. La réaction de cette protéine conduit à la mort du pollen incompatible par une série d’étapes, puis le pollen est dégradé par apoptose.

En 2010 et après, des biologistes moléculaires ont fait dériver et transformé ces connaissances en écrivant que si une espèce exprime une S-RNAse H, elle serait du type gamétophytique et que celle qui exprimerait une SRK-Kinase serait du type sporophytique.

L’olivier n’exprime pas de S-RNAse H au niveau de la part femelle au stade de l’incompatibilité. Les chercheurs en ont déduit qu’il était du type sporophytique. Les mêmes chercheurs, pour être sûrs de leur coup, ont publié simultanément, dans un autre article, que l’olivier était du type gamétophytique. Ainsi, ils étaient sûrs d’avoir un article en accord avec les publications qui concluent au type gamétophytique ou au type sporophytique. La rigueur de telles publications laisse pantois. Les chercheurs qui citent ces articles dans leurs publications n’ont aucune idée de ce que sont les types gamétophytique et sporophytique. C’est consternant.

L’AUTOFÉCONDATION CHEZ L’OLIVIER : MYTHE OU RÉALITÉ ?

Chez toutes les espèces qui exprime l’incompatibilité, quelle soit du type GSI ou SSI, l’auto-incompatibilité d’un individu est stricte. Or chez l’olivier les variétés sont notoirement plus ou moins auto-fertiles. Ceci mérite une explication, car c’est bien une réalité.

Qu’un espèce soit GSI ou SSI la part variable femelle ou mâle d’un S-allèle peut avoir mutée, et même si l’événement est très rare, comme l’individu devient auto-fertile, il sera repéré lors d’une expérience d’ensachage, réalisée par les améliorateurs des plantes. Ils posent des dizaines de milliers de sacs chaque année pour contrôler les croisements. Avant que les améliorateurs ne posent des sacs de telles mutations ne pouvaient être repérées, et donc chez l’olivier, on ne savait pas avant les années 1975 si une variété était auto-fertile ou pas. Les S-allèles qui ont perdu la faculté d’agir sur l’incompatibilité sont désignés S0. Il en existe chez toutes les espèces : cerisier, amandier abricotier, pétunia, tabac, choux, colza, tournesol… Les améliorateurs les ont soigneusement repérés et les utilisent pour fabriquer des lignées pures chez les espèces auto-incompatibles, puis fabriquent les hybrides F1 chez la tomate, l’aubergine, le tournesol … et bien d’autres espèces cultivées de nos jours.

Dès que dans l’équipe dirigée par Pierre Villemur, les chercheurs ont ensaché des inflorescences chez l’olivier, ils ont découvert :

1) que certaines variétés ne produisaient pas de pollen (ex Lucques et Olivière) et

2) que pour les variétés qui en produisaient, la nouaison était souvent nulle, voire très faible (Corniale, Picholine), mais que pour certaines autres variétés, il y avait plus de fruits (Cailletier, Salonenque).

Le modèle des S-allèles a l’avantage de permettre la comparaison de l’auto-fertilité des variétés à la paire d’allèles. Sur plus de 100 variétés élucidées pour leur paire d’allèles, il est apparu que la paire d’allèles est corrélée au niveau d’auto-fertilité. On pouvait donc construire un modèle et le tester.

Le modèle est basé sur :

1) plus les niveaux de dominance sont éloignés entre les 2 S-allèles de la paire, plus la variété est auto-fertile. Donc
R4R6 est prédit très auto-fertile – 3 niveaux de dominance de différence
R1R6, R3R6, et R5R6 sont prédits de même niveau d’auto-fertilité – 2 niveaux de dominance de différence
R2R4 est prédit d’un bon niveau d’auto-fertilité – 2 niveaux de dominance de différence
R2R6 est prédit peu auto-fertile- 1 niveau de dominance de différence
R1R2, R2R3, et R2R5 sont prédits de même niveau d’auto-fertilité – 1 niveau de dominance de différence
R1R4, R3R4, et R5R4 sont prédits de même niveau d’auto-fertilité – 1 niveau de dominance de différence
R1R3, R1R5, et R3R5 sont prédits au niveau d’auto-fertilité le plus faible – 0 niveau de dominance de différence.

Ceci est vérifié expérimentalement pour les paires avec R2, R3, R4, et R6. Mais pas pour les paires avec R1 et R5, il a donc fallu ajuster le modèle.

2) pour les paires qui portent R1 le taux de l’auto-fertilité est diminué de 0,15

3) pour les paires qui portent R5 le taux de l’auto-fertilité est augmenté de 0,2

4) une variété qui porte R1 et R5 est auto-fertile à 0,15

Ceci est très utile expérimentalement. Si un croisement implique en femelle une paire qui introduit de l’auto-fertilité (R4R6, R2R4, … et même R1R5) il faudra vérifier soigneusement que les fruits sont bien dus au croisement par des tests moléculaires de paternité. Pour les croisements avec les paires R1R2, R1R4, R1R3 s’il y a nouaison, à priori c’est dû au croisement, il faudra néanmoins vérifier l’absence de fécondation illicite par des tests moléculaires de paternité.

Quant à l’autofécondation des variétés mâle-stériles détectées avec les marqueurs moléculaires comme chez Lucques et Olivière, il faut distinguer le résultat de l’’interprétation – l’embryon prélevé chez Lucques, puis analysé peut très bien ne montrer aucun marqueur des variétés que l’on considère comme des polliniseurs possibles. Ce point est traité avec les tests de paternité.

ET LES TESTS DE PATERNITÉ ?

Quand ils sont utilisés avec toutes les garanties spécifiées dans leur mode d’emploi – globalement,
1) il faut que les individus étudiés soient diploïdes (c’est le cas de l’olivier),
et
2) il ne faut pas dans le périmètre de collecte des embryons, qu’il y ait de sources de pollen autres que celles identifiées par les individus dont on a étudié les profils moléculaires (ce n’est pas le cas chez l’olivier)
alors ils conduisent à des analyses dont les conclusions sont fiables.

Ils sont alors utiles pour aider au diagnostic de compatibilité, ils permettent d’éliminer des erreurs dues à la confusion du croisement avec l’autofécondation sous un sac imperméable au pollen, enrobant des inflorescences de la femelle.

Pourtant, chez l’olivier, ils sont utilisés pour identifier la variété père d’un embryon obtenu sur une variété femelle de la base de données. La variété hôte, bien identifiée et contrôlée comme telle, par comparaison du profil moléculaire de l’embryon, permet d’identifier les fragments qu’ont apporté un grain de pollen. Un programme informatique mouline les données moléculaires des variétés pour identifier celle qui a donné le profil moléculaire du grain de pollen. Plusieurs interrogations subsistent.

Examinons les éléments qui peuvent contrecarrer les interprétations.

La SocX qui réalise le test a construit une base de données des profils moléculaires de près de 200 variétés cultivées en France avec quelques variétés à diffusion mondiale. C’est un outil puissant, très utile, qui fait la renommée incontestable de SocX pour identifier les variétés d’olivier, et d’autres espèces.

Quand un arbre hôte de la variété d’olivier Roussane donc connu pour son profil moléculaire est dans la base de données de SocX, quand elle est utilisée en femelle pour récolter des fruits, puis obtenir des noyaux et enfin des embryons, la comparaison du profil moléculaire de l’embryon et de la maman conduit à identifier les marqueurs qui sont chez l’embryon et absents chez la maman. Forcément pour chaque embryon ces marqueurs viennent d’un seul père, mais pour les différents embryons sur un même arbre, il peut y avoir des pères différents.
Roussane est bien caractérisée par ses 10 paires d’allèles, avec 2 tailles d’allèles pour chaque marqueur. Il est alors facile de déduire du profil de l’embryon, les marqueurs qui ont été donnés par la maman et ceux donnés par le papa recherché. Il est donc possible de reconstruire, locus par locus, le profil moléculaire du grain de pollen qui vient du père.
Mais alors, le profil moléculaire reconstruit du grain de pollen est-il dans la base de données ?
Il suffit de regarder s’il y est.
Or le profil moléculaire du grain de pollen n’y ait pas, puisque les variétés sont diploïdes et le pollen haploïde. Maintenant, il faut alors rechercher dans la base de données quelle variété a donné le grain de pollen qui correspond au profil reconstruit.
Un programme informatique fait cette recherche et donne les variétés de la base de données qui auraient pu donner le profil moléculaire reconstruit. Pour chaque variété le programme donne une vraisemblance (lodscore) calculée d’après les fréquences alléliques des marqueurs, et SocX ne retient comme donneur de pollen que les variétés qui ont 99 % de chance d’avoir donné le grain de pollen.
Tout est donc parfait.          
Et donc SocX communique que le papa du grain de pollen X est Verdon. Il suffit alors de rechercher Verdon auprès de l’arbre de Roussane qui a donné l’embryon, et s’il y est – on affirme que la méthode est bonne et que Verdon est un polliniseur de Roussane
Oui, … mais non, apparemment seulement.          
La vraisemblance a été calculée d’après la base de données or l’arbre de Roussane est entouré dans un rayon de 1,5 km d’arbres de variétés dont certaines sont dans la base de données et autres n’y sont pas. Le calcul de la vraisemblance en est forcément modifié, et de plus on n’a pas les moyens techniques de recenser tous les arbres sur près de 70 ha autour de l’individu de Roussane.
Et donc la vraisemblance de l’identification du papa n’est pas connue.
Pour chaque lieu où a été prélevé un embryon, il faudrait faire le recensement des donneurs de pollen possibles. Le coût du recensement est exorbitant et l’on est jamais sûr de ne pas avoir oublié un donneur de pollen parmi les arbres férastres ou abandonnés du secteur.
Si 10 marqueurs sont utilisés pour identifier les variétés, les pères possibles, les arbres férastres et les embryons, le programme informatique utilisé pour identifier le père, alors sur la zone où l’on recherche le père, on a une puissance d’identification insuffisantes des pères possibles, car il n’y aura pas suffisamment de marqueurs discriminants de chaque variété dans le périmètre, on aura alors des doutes sur les conclusions.

Voyons maintenant combien 10 locus de marqueurs moléculaires peuvent identifier le pollen de l’olivier.

Un arbre adulte d’une trentaine d’années porte (cinq cents mille) 5 10⁵ fleurs.
Chaque fleur contient 2 étamines,
Chaque étamine contient environ 10⁵ (cent mille) grains de pollen ;
Chaque arbre d’olivier peut avoir reçu du pollen d’un autre individu dans un cercle de 1,5 km dont il est le centre ; soit une surface de presque 7 km² ; avec 240 arbres par ha environ (700 x 240 arbres) soit 168000 arbres (au maximum en verger conventionnel)

En analysant 1 embryon on analyse 1 grain de pollen. Le nombre de grains de pollen du nuage au-dessus du cercle est de : (5 10⁵ x 2 x 10⁵ x 168000) soit 1,68 10¹⁶
soit 16,8 million de milliards) or avec 10 marqueurs moléculaires microsatellites qui chacun auraient 10 allèles, il est possible de différencier au maximum 10 milliards grains de pollen. De fait, si on dispose de microsatellites avec respectivement, 4, 6, 8, 5, 6, 7, 9, 5, 6 et 8 allèles, alors on peut différencier 4×6×8×5×6×7×9×5×6×8 = 87 091 200 soit environ 90 millions de types de grains de pollen.

De fait les marqueurs identifient sûrement 1 grain de pollen sur 50 milliards (16,8 10¹⁶ / 87 091 200). Comme les variétés portent parfois le même allèle, on ne pourra établir la paternité que sur des allèles qui sont discriminants. De ce fait, les statistiques s’effondrent.

Quand les tests de paternité sont utilisés chez les autres espèces, ils ont, au préalable, été criblés pour être discriminants chez les pères. Ce n’est pas le cas chez l’olivier.

Les arbres férastres sont des descendants des variétés et donc ils en portent certains des marqueurs discriminants, ce qui va entraîner des confusions de père, si ils ne sont pas tous répertoriés.

Donc, si l’on ne connaît pas la fréquence des marqueurs moléculaires dans la région où a été prélevé l’embryon, l’erreur de calcul de la vraisemblance ne permet pas des conclusions – sur la paternité ou s’il y a eu auto-fécondation.

Chez Lucques et Olivière, et donc chez toute variété utilisée comme femelle on conclura illégitimement à une auto-fécondation quand il n’y a aucun marqueur discriminant d’un mâle, alors que l’absence d’un marqueur dans un test de paternité ne peut être interprétée ainsi. Il faut donc corriger cette interprétation du résultat – s’il n’y a pas de marqueur discriminant d’un mâle alors on ne peut rien dire de l’origine de l’embryon, surtout pas que c’est une auto-fécondation quand la variété est mâle-stérile !

En effet, un grain de pollen circulant anonyme qui arrive, germe et féconde l’ovule d’une femelle peut ne porter aucun marqueur discriminant des mâles que l’on a analysé et qui sont répertoriés dans la base de données. La probabilité qu’un tel grain de pollen soit formé se calcule par les fréquences des marqueurs moléculaires utilisés dans la base de données.

L’efficacité des tests de paternité se mesurera sur les conséquences pratiques qu’ils entraîneront dans les vergers. Notons aussi, que pour chaque lieu il faut recommencer toutes les analyses. Alors qu’une paire d’allèles est fixée une fois pour toute. Quand on change de lieu, chaque variété conserve sa paire de S-allèles, alors que les fréquences alléliques des marqueurs changent totalement.

Musho (1977), Ouksili (1983), Moutier et al. (2006, 2009) et Farinelli et al (2006, 2014) ont montré que le pollen de Picholine (R1R3) est incompatible avec les stigmates de Lucques (R2R3), Tanche (R2R3), et Santa-Caterina (R2R3). Or les tests de paternité donnent avec une forte fréquence, dans le rapport Pollinoliv, Picholine comme le père des embryons récoltés sur Lucques. Soit tous ces auteurs avec des croisements contrôlés ont délivré une conclusion erronée, soit les tests de paternité conduisent à une conclusion erronée. Le modèle des S-allèles a été bâti en parti sur le fait que Picholine et R2R3 sont incompatibles. Or, les tests de paternité conduisent dans Pollinoliv et dans les conclusions diffusées par le CODC a des concordances : Picholine compatible avec Olivière, etc, et les oppositions soulignées.

Le test de paternité est un outil qui aide à la décision en éliminant des erreurs possibles. Pour évaluer leur efficacité il faudrait que les profils moléculaires obtenus des embryons analysés, tels qu’ils sortent des séquenceurs, soient ré-examinés, car leur interprétation conduit à une conclusion contradictoire avec les tests sous sacs.

POURQUOI FAIRE SIMPLE QUAND ON PEUT FAIRE COMPLIQUÉ !

Nous recommandons depuis plus de trois ans de combiner les outils : des embryons obtenus sous un sac, avec des tests de paternité sur une mère (forcément) connue et soit pour l’autofécondation (pas de pollen apporté), soit utilisé en croisement par apport du pollen d’un père parfaitement identifié, alors nombre d’incertitudes s’élimineraient.
Néanmoins la ségrégation des allèles rend les grains de pollen sans les bons allèles (ceux discriminants), opaques à toute interprétation. Environ la moitié des embryons restera sans père attribué (Voir Mookerjee, Wu, Diaz, de la Rosa, Seifi et Marchese). On le sait, et donc le coût des analyses efficaces s’en trouve doublé. Quand l’information apportée par les marqueurs sous sac est certaine, on doit l’accepter.

1) Si quelques fragments de chaque embryon analysé sont absents chez la mère, mais sont présents chez le donneur de pollen connu, alors le père présumé est considéré comme le vrai père avec une très forte probabilité. Comme aucun fragment ne prouve une contamination, il n’y a pas de raison d’en suspecter une. Néanmoins, on ne peut écarter qu’une variété avec quelques marqueurs discriminants communs avec ceux du père présumé ait donné quelques uns des embryons analysés. Ce sont les analyses de marqueurs ultérieures réalisées en cartographie génétique qui parfois, révèlent qu’un individu issu de l’embryon récolté sous un sac, est en fait issu d’une fécondation illicite, ceci est illustré par de nombreux exemples.

2) Si les embryons récoltés sous le sac présentent des marqueurs absents chez le père présumé et absent chez la mère, le père est alors rejeté avec certitude. Le test de paternité fonctionne ici sans probabilité.

3) Une contamination par du pollen circulant se détectera chez les embryons qui portent des marqueurs qui ne sont présents ni chez le père ni chez la mère. Si dans la base de données aucune variété n’a pu donner ces marqueurs, c’est qu’il existe un individu non répertoriée dans le périmètre de récolte de l’embryon.
4) mais attention, tous les embryons n’auront pas de père identifié du fait de la ségrégation des marqueurs hétérozygotes chez chaque variété. Les embryons qui ne porteront pas des fragments discriminants du père par rapport à la mère, restent non informatifs. Il ne faudra alors pas considérer les embryons sans aucun fragment du père, comme provenant d’autofécondation ou de fécondation par du pollen circulant.

On pourrait donc dès lors, par analyse des embryons obtenus sous le sac de protection, estimer par comptage des fruits, le taux de l’autofécondation en absence et en présence du pollen apporté depuis chaque polliniseur étudié. On pourra aussi déterminer le père de la moitié des embryons.

Néanmoins, pour l’autre moitié des embryons on ne saura rien, mais s’il n’y a aucune raison de suspecter des anomalies, on pourra considérer qu’ils proviennent de grains de pollen du bon père, ou qu’il s’agit bien d’une autofécondation.
La méthode des tests de paternité ne permet alors pas de déterminer les taux relatifs d’autofécondation et de croisements, voire de contaminants, car les coûts des analyses moléculaires supplémentaires requises deviendraient rapidement prohibitifs, il faut alors compter les fruits (voir l’efficacité des tests moléculaires chez Marchese et al. 2015).

DES CONCLUSIONS S’IMPOSENT

Le but de tous les contributeurs à une meilleure connaissance de la fructification chez l’olivier est d’améliorer les profits de la filière oléicole. Les travaux de recherche conduisent à des améliorations possibles :
1) qu’il faut maintenant vérifier en vraie grandeur dans les vergers de production. Vérifier veut dire que l’apport de nouveaux polliniseurs doit
* Augmenter la production (après greffage) ou plantation (12 % de polliniseurs différents)
* Augmenter la qualité des fruits (calibre, moins de coulure, …).

2) qu’il faut maintenant labelliser chez les pépiniéristes  
* Exiger la fiche de conformité au standard des plants achetés pour chaque variété. Le standard moléculaire serait à généraliser.
* Exiger pour chaque variété de production achetée, la fiche des polliniseurs possibles
* Exiger la fiche de donneur de pollen pour chaque polliniseur acheté. Vérifier la compatibilité variété de production et polliniseur vendu
* Ne vous fiez à aucun marketing qui vante l’auto-fertilité des variétés. Même si une variété est auto-fertile, elle produira toujours plus de fruits avec des polliniseurs.
* Ne vous fiez à aucun marketing qui vante la compatibilité de 2 variétés, sauf si la source se réfère aux travaux cités ici.

3) Si vous ignorez la paire de S-allèles de votre variété commerciale déjà en place

* Plantez ou greffez systématiquement des polliniseurs R1, R2, R3, R5, et R6 dans votre verger
* Contribuez à déterminer la paire de S-allèles de votre variété. Contactez nous on vous dira comment faire et on vous y aidera.

4) Chacun tirera d’autres conclusions comme il l’entend. Néanmoins, Il y a de nombreux pièges avec les marqueurs moléculaires :
* la présence des marqueurs n’est pas suffisante pour attribuer la paternité à une variété qui les porte.
* surtout l’absence d’un marqueur dans un embryon ne peut pas s’interpréter simplement et ne peut conduire à une seule interprétation et conclusion.
* Il faudra donc bien distinguer les résultats, que sont les profils moléculaires obtenus des embryons, des conclusions       –
** Les devront être donnés dans un tableau formaté avec les tailles sur 2 colonnes pour les 2 allèles
** Les conclusions seront toujours discutables et à discuter pour en tirer le meilleur.

Pardon d’avoir été non pas long, mais très long.

[1]     Chaque individu reçoit à la fécondation, pour chaque gène, un des 2 allèles de chacun de ses parents

cf. l’envoi aux membres du groupe « pollinisationolivier » (yahoogroupes.fr)  le 09/11/2016.

Nouaison – Crédit photo : André Bervillé